Previsione di splicing aberrante nei tessuti umani

Sep 02, 2023

Nature Genetics volume 55, pagine 861–870 (2023) Citare questo articolo

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Lo splicing aberrante è una delle principali cause di malattie genetiche, ma la sua rilevazione diretta nei trascrittomi è limitata ai tessuti clinicamente accessibili come la pelle o i fluidi corporei. Sebbene i modelli di apprendimento automatico basati sul DNA possano dare la priorità a varianti rare per influenzare lo splicing, le loro prestazioni nel prevedere lo splicing aberrante specifico del tessuto rimangono non valutate. Qui abbiamo generato un set di dati di riferimento sullo splicing aberrante, che copre oltre 8,8 milioni di varianti rare in 49 tessuti umani dal set di dati Genotype-Tissue Expression (GTEx). Con un richiamo del 20%, i modelli all'avanguardia basati sul DNA raggiungono una precisione massima del 12%. Mappando e quantificando l'utilizzo del sito di giunzione tessuto-specifico a livello del trascrittoma e modellando la competizione tra isoforme, abbiamo aumentato la precisione di tre volte con lo stesso richiamo. L'integrazione dei dati di sequenziamento dell'RNA di tessuti clinicamente accessibili nel nostro modello, AbSplice, ha portato la precisione al 60%. Questi risultati, replicati in due coorti indipendenti, contribuiscono sostanzialmente all'identificazione di varianti con perdita di funzione non codificante e alla progettazione e all'analisi della diagnostica genetica.

L'identificazione delle varianti del DNA con perdita di funzione non codificante rappresenta un grave collo di bottiglia nell'interpretazione dell'intero genoma, poiché è difficile prevedere la funzione al di fuori delle regioni codificanti1. Le varianti che alterano lo splicing rappresentano un'importante classe di varianti con perdita di funzione non codificante perché possono portare a isoforme di RNA drasticamente alterate, ad esempio, inducendo frameshift o ablazioni di domini proteici funzionalmente importanti. Se la variante altera fortemente la scelta dell'isoforma di splicing, l'abbondanza rimanente di isoforme di RNA funzionali può essere ridotta a tal punto da perdere la funzione del gene. Data l'importanza dello splicing per l'interpretazione delle varianti, in particolare nella diagnostica delle malattie rare e in oncologia, sono stati sviluppati algoritmi per prevedere se le varianti influenzano lo splicing2,3,4,5,6,7,8,9. Tuttavia, solo di recente, nei tessuti umani sono stati riscontrati eventi di splicing aberranti, ovvero rare e grandi alterazioni nell'utilizzo delle isoforme di giunzione10,11,12. Sebbene sia stato proposto un metodo per dare priorità a posteriori alle varianti rare causali candidate per gli eventi di splicing aberranti osservati12, il problema successivo, cioè prevedere tra le varianti rare quali si tradurranno in splicing aberrante, non è stato affrontato.

Qui, abbiamo deciso di stabilire modelli che prevedano se una variante rara si associa a uno splicing aberrante in un dato tessuto umano. Innanzitutto, abbiamo presupposto che fosse disponibile solo il DNA e in seguito abbiamo considerato ulteriormente i dati complementari di sequenziamento dell'RNA (RNA-seq) di tessuti clinicamente accessibili (CAT) (Fig. 1).

Abbiamo deciso di prevedere se varianti rare si associano a splicing aberrante in 49 tessuti umani. a, Abbiamo stabilito un punto di riferimento completo per lo splicing aberrante elaborando campioni GTEx con un chiamante di splicing aberrante recentemente pubblicato10 in base al quale potremmo valutare e sviluppare predittori che potrebbero prendere come input la sequenza del DNA e, facoltativamente, i dati RNA-seq dei CAT. b, Il benchmarking ha rivelato prestazioni modeste degli algoritmi attualmente utilizzati basati solo sul DNA, un sostanziale miglioramento delle prestazioni quando si integrano questi modelli con SpliceMap, una mappa quantitativa dello splicing tessuto-specifico che abbiamo sviluppato in questo studio e ulteriori miglioramenti includendo anche misure dirette di aberranti splicing nei tessuti accessibili.

Abbiamo creato un benchmark utilizzando il chiamante di splicing aberrante FRASER (Find RAre Splicing Events in RNA-seq)10 su 16.213 campioni di RNA-seq del set di dati Genotype-Tissue Expression (GTEx), che comprende 49 tessuti e 946 individui. Rispetto ad altri metodi di rilevamento di valori anomali di splicing11,12, FRASER ha costantemente mostrato il massimo accordo con i predittori basati su sequenze ed è stato quindi successivamente utilizzato per le nostre valutazioni (Dati estesi, Fig. 1). Per ogni individuo, abbiamo considerato ogni gene codificante proteina portante almeno una variante rara (frequenza allelica minore (MAF) inferiore allo 0,1% in base al database di aggregazione del genoma (gnomAD)13 e trovata in non più di due individui su GTEx) e impostato per prevedere in quale tessuto, se presente, questo gene è impiombato in modo aberrante. Abbiamo definito un gene da splicing aberrante in un campione se è stato chiamato come valore anomalo di splicing significativo a livello del trascrittoma e con un'ampiezza sufficiente (percentuale differenziale di splicing (Ψ) maggiore di 0,3); Metodi e vedere Dati estesi Fig. 1 per risultati con cut-off alternativi). Studi precedenti avevano riferito che fino al 75% degli eventi di splicing aberrante nei campioni di RNA-seq GTEx non sono replicati nei tessuti10,12 e quindi possono riflettere artefatti tecnici o splicing aberrante che non è determinato geneticamente. Abbiamo quantificato l'arricchimento di valori anomali di splicing replicati attraverso i tessuti dello stesso individuo rispetto alla distanza dalla variante rara più vicina e abbiamo scoperto che erano arricchiti fino a una distanza di 250 paia di basi (bp) (Dati estesi Fig. 2). Pertanto, abbiamo anche richiesto che una variante rara fosse a meno di 250 bp di distanza dai confini di qualsiasi introne associato al sito di giunzione aberrante (Metodi e dati estesi Fig. 3). Questo filtro ha prodotto risultati simili al filtraggio per eventi aberranti replicati con l'ulteriore vantaggio di essere applicabile a coorti indipendenti che hanno un singolo campione per individuo (Dati estesi Fig. 4).